如何设计新型冠状病毒疫苗 以避免ADE效应？——冠状病毒ADE效应的机理初探 [JVI]
冠状病毒具有ADE效应已经是很多人都知道的一个事实了，很多体内外的研究都证实了这一点，这也是 研制针对新型冠状病毒疫苗上的一个重大障碍。了解冠状病毒的ADE机理将是设计出可以避免产生ADE疫苗的关键所在。本文…
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ADE是 antibody-dependent enhancement 的缩写，中文“抗体依赖的增强作用”。
ADE或者“抗体依赖的增强作用”最早在登革病毒感染过程中被发现。
登革病毒感染引起的最主要的疾病就是登革热（dengue fever）。一般是一种自限性疾病，也就是危害不大。这是一种主要在热带亚热带流行的蚊媒传染病，也就是蚊子吸血传播的。传播媒介是我们所知的“花蚊子”，也就是伊蚊，包括埃及伊蚊和白纹伊蚊。
上面说了登革病毒感染引起的登革热主要是一种自限性疾病，但是登革病毒有四个血清型。登革病毒——dengue virus，DENV。DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4。血清型是分子生物学大发展以前用于分类的一个很重要的手段，依据的是机体产生的抗体对病毒的反应性进行分类的。
至于登革病毒分为4种血清型，也就是说如果一个人被DENV-1感染并恢复之后，这个人会产生针对DENV-1的抗体，所以一般再被DENV-1感染之后几乎不会有什么反应，相当于打过疫苗了。但是针对DENV-1的抗体并不能保护这个人免受DENV-2的感染，所以感染DENV-2之后还会发病。
而且这个人在感染DENV-1之后再感染DENV-2有可能症状会更严重，这时候就是ADE效应了。
一个人两次感染不同血清型的DENV可能会造成重症登革感染（包括登革出血热/DHF和登革休克综合征/DSS）。教科书的传统解释是1）单核细胞为登革病毒的靶细胞，初次感染之后产生的抗体（IgG）不能中和第二次另一种血清型的病毒，反而能够介导病毒通过抗体的Fc更容易感染单核细胞。使得产生的子代病毒更多。2）而过度活化的单核细胞和T淋巴细胞分泌的细胞因子会更多，让血管通透性增加，造成了出血、甚至休克这种严重症状。
所以，传统的ADE效应主要就是认为，抗体不能中和病毒，反而当了一个“特洛伊木马”，让病毒更容易感染单核细胞，这是传统的解释。2017年《科学》杂志有一篇报道拓展了这个理论，认为登革病毒的ADE效应的机理要归功于IgG1亚类抗体对于非岩藻糖化的Fc受体FcγRIIIA 具有很高的亲和力，非中和性抗体诱导体内血小板的减少，进而导致血小板减少症[1]。当时有过科普，略过。
突破性进展，登革病毒ADE效应机理解释拓展
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小结：ADE效应“抗体依赖的增强作用”就是说抗体不能中和病毒，反而当了“特洛伊木马”，让病毒感染免疫细胞的能力更强，产生更多的子代病毒，造成严重症状。
【二】冠状病毒研究中发现的ADE效应。
目前我个人检索到的关于冠状病毒的ADE效应是1981年发表的（欢迎补充），研究对象是猫传染性腹膜炎病毒（ feline infectious peritonitis virus，FIPV）。
插一句，养宠物的可能知道这个“猫传腹”这个病，也可能有人知道瑞德西韦（GS-5734）的前药（GS-441524）是治疗猫传腹的特效药。
有两篇研究，一篇是过继免疫，一篇是疫苗研究。
过继免疫的意思就是把已经恢复的机体内的抗体回输给未免疫的个体，再在这些个体上进行病毒感染的评价。
Antibody-mediated enhancement of disease in feline infectious peritonitis: comparisons with dengue hemorrhagic fever.[2]
幼猫过继免疫具有针对FIPV高滴度抗体的猫血清，之后再用FIPV攻击会使得免疫幼猫比对照幼猫更快的出现疾病症状（包括热血症/pyrexia、黄疸/icterus和血小板减少/thrombocytopenia），并且死亡更快（M±SEM：10±0.6天 vs 28.8±8.3天）。
疫苗研究中最早的是病毒载体疫苗，用的是消灭了天花的大名鼎鼎的痘苗病毒，改造后的痘苗病毒基因组里携带了FIPV的S基因，所以可以诱导机体产生针对S蛋白的抗体。
Early death after feline infectious peritonitis virus challenge due to recombinant vaccinia virusimmunization.[3]
利用痘苗病毒（天花疫苗）重组了FIPV的S蛋白，可以在小鼠体内诱导产生中和抗体。但是当幼猫免疫重组了FIPV-S的痘苗病毒之后再免疫只能获得非常低效价的中和抗体。而之后进行FIPV攻毒，免疫组的幼猫死亡时间比对照组（野生型痘苗病毒）更早。
但是这些早期研究的结果都提示针对“猫传腹”的疫苗研究很不乐观。养宠物的可能还知道，在8周后要给“主子”打“三联疫苗”预防猫瘟、猫鼻支、猫杯状，另外还要打狂犬疫苗。但是到现在为止“猫传腹”并没有疫苗可用。也侧面说明了冠状病毒疫苗的难度。
上面都是说的猫的冠状病毒，那么人的冠状病毒里研究是啥样的呢？
我们现在转到SARS-CoV和MERS-CoV上。
Evaluation ofAntibody-Dependent Enhancementof SARS-CoV Infection in Rhesus Macaques Immunized with an Inactivated SARS-CoV Vaccine.[4]使用灭活SARS-CoV疫苗免疫的恒河猴中抗体依赖增强SARS-CoV感染的评价。
Immunodominant SARSCoronavirusEpitopes in Humans Elicited both Enhancing and Neutralizing Effects on Infection in Non-human Primates.[5]SARS-CoV在人群中的主导抗原表位可在非人类灵长类同时引起中和抗体应答和感染增强作用。
Antibody-dependentinfection of human macrophages by severe acute respiratory syndromecoronavirus.[6]抗体依赖的SARS-CoV感染人巨噬细胞。
Anti-spikeIgGcausessevereacutelunginjurybyskewingmacrophage responses duringacute SARS-CoVinfection.[7]针对S蛋白IgG抗体通过偏移巨噬细胞应答在急性SARS-CoV感染中引起急性肺损伤（2019年文章，港大陈志伟/袁国勇团队）
ImmunizationwithinactivatedMiddleEastRespiratorySyndromecoronavirusvaccineleadstolungimmunopathologyonchallengewithlivevirus.[8]针对MERS-CoV的灭活疫苗免疫后可导致病毒攻击后引起肺部病理损伤。
SARSCoVsubunitvaccine:antibody-mediatedneutralisationandenhancement.[9]
简单介绍2019年港大陈志伟/袁国勇团队的JCI insight文章概要【4】。文章使用的疫苗是重组安卡拉株（MVA）的痘苗病毒，这个病毒载体的特点是进入细胞后只能复制一次。基因组是不完整的，不能产生完整的子代病毒。所以诱导机体免疫应答的效果较好，但又非常安全。以前的复制型的天花减毒活疫苗（牛痘苗）会有不少人产生严重的副反应，接种部位也有不小的皮肤损伤（可参考专栏文章：痘病毒2——正痘病毒属 之 天花病毒（Variola virus））。
MVA本身作为预防天花（smallpox）的疫苗，目前已经完成了III期临床，文章发表于2019年11月的NEJM上[10]，并在德国巴伐利亚（Bavaria）获得了许可。
陈志伟/袁国勇团队的JCI insight文章首先使用了MVA对照疫苗和表达SARS-CoV-S蛋白的疫苗各免疫接种了8只猴子，第八周用SARS-CoV鼻腔攻毒，第九周和十三周进行病理学检查，并在免疫后就开始取血检测中和抗体效价和病毒载量。
可以看到的，免疫组血清的中和抗体在第二周就达到很高的滴度并一直维持到攻毒之后（5左下，蓝线）。而对照组的中和抗体在攻毒后才开始升高（5左下，黑线）。
相应的，咽拭子的病毒载量也是疫苗组比对照组要低得多（5下，实心蓝圈vs空心黑圈）。
但是，肺部脏器的病理学评分反而是疫苗组比较重（5右下，实心蓝柱子vs空心黑柱子）！
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以上是疫苗免疫，那么过继免疫呢？
过继免疫的流程是2只完全对照猴子静脉注射不相关的抗体IgG对照200mg，实验组用了两个剂量的针对SARS-CoV-S的抗体，分别是5mg和200mg。注射两天后鼻腔攻毒SARS-CoV。在攻毒后2天和21天分别进行病理学检查。
可以看到的，三组血清的中和抗体区分很明显，高剂量组（5左下，深色蓝线）抑制很高，低剂量组（5左下，浅色蓝线）先低后高，而对照组在接触病毒一周后才开始升高（5左下，黑线）。
但是和疫苗免疫组类似，肺部脏器的病理学评分在S抗体组（无论剂量高低）都比对照要重（5右下，实心深色或浅色蓝柱子vs空心黑柱子）！
这部分结果表明，针对S的抗体是疫苗免疫猴子后动物肺部病理损伤指标升高的原因。
【三】冠状病毒ADE效应的原理何在？
还是介绍2019年港大陈志伟/袁国勇团队的那篇JCI insight文章【4】。
前面的结果说明针对S的抗体是疫苗免疫猴子后动物肺部病理损伤指标升高的原因之后就开始了机理的探寻——
Anti–S-IgG induced severe lung injury during acute SARS-CoV infection. 【】抗S-IgG抗体在急性SARS-CoV感染期间诱发严重的肺部损伤。
S-IgG failed to prevent SARS-CoV lower respiratory tract infection and amplified IMM infiltration and accumulation in the lungs.【】 S-IgG抗病并不能预防SARS-CoV感染下呼吸道，并放大了肺部的炎症性单核巨噬细胞（IMM ）的浸润和累积。
Alveolar monocytes/macrophages assumed a wound-healing function as early as 2 dpi in macaques not treated with S-IgG.【】 在未使用S-IgG处理的猴子中，肺泡单核细胞/巨噬细胞早在2 dpi就具有伤口愈合功能。
S-IgG treatment skewed wound-healing macrophage response in the lungs during acute SARS-CoV infection.【】 S-IgG处理会在急性SARS-CoV感染下偏转肺部巨噬细胞的应答。
Onset of an antibody response prior to viral clearance is associated with abrogated wound healing responses and increased IMM lung infiltration in unvaccinated Chinese rhesus macaques. 【】未免疫的恒河猴体内病毒清除前的抗体应答与伤口愈合应答的消除和肺部浸润的炎症性单核巨噬细胞增加相关。
S-IgG modifies functional response of alternatively but not classically activated macrophages to SARS-CoV infection. 【】S-IgG可以在SARS-CoV感染时通过旁路而非经典途径激活巨噬细胞应答。
Deceased SARS patients displayed higher levels of serum NAbs, accumulated proinflammatory, macrophages infiltration, and absence of wound-healing macrophages in the lungs. 【】SARS死亡患者表现出较高的血清中和抗体（NAb）水平，促进肺部促炎性巨噬细胞浸润升高、促进伤口愈合的巨噬细胞减少。
Antisera from deceased SARS patients skewed wound-healing response during SARS-CoV infection partially through the FcγR. 【】SARS死亡患者的组织修复应答的偏移部分通过FcγR（IgG受体）介导。
归纳起来就是说，不管是猴子还是SARS患者，他们肺部的促进组织损伤修复的巨噬细胞少，反而促进炎症的巨噬细胞多，而这个现象主要是由针对S-IgG的中和抗体所介导的，而且组织修复这部分的应答还跟IgG抗体的受体（FcγR）有关。
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除此之外，近期还有一篇在线发表于美国微生物学会《病毒学杂志》的一篇文章。里面提出了冠状病毒ADE的机理也是S-RBD的抗体可以通过Fc段介导冠状病毒进入细胞，类似前面提到的登革病毒感染免疫细胞机理[11]。
文章利用的是MERS-CoV，MERS-CoV的受体是DPP4，不是ACE2。
首先要了解冠状病毒的S蛋白，也就是刺突（花冠）。
而S蛋白有两个亚基，上端球状的（蓝色）是结合受体的部分S1亚基，下端（浅蓝色）是介导病毒包膜与细胞膜融合的亚基S2，中间的酶切位置是S1/S2酶切位点。而S2上还有一个S2'的酶切位点，可以让融合肽上的疏水性的氨基酸插入细胞膜，从而诱导病毒包膜与细胞膜的融合。
文章的研究发现用针对S-RBD的MERS的单克隆抗体(mAb)处理之后，可以增强S2'的酶切活性。而这一点跟结合受体DPP4之后发现的现象是一模一样的。说明的抗体可以诱导S2'的裂解。
SARS-CoV S-RBD解释——S基因是冠状病毒基因中的一种，编码S结构蛋白，S蛋白就是冠状病毒的“花冠”，是其威力所在。冠状病毒感染人体的前提就是S蛋白与人体细胞表面的受体ACE2蛋白成功结合，没有它，病毒就无法侵入。
而S蛋白受体结合域（RBD），就是S蛋白与人体细胞的ACE2受体结合的区域，病毒能够进入哪些动物的细胞、感染的效率有多高，都跟它有关。我们可以把S蛋白比喻成钥匙，而RBD就是钥匙的 “牙花”（钥匙的锯齿部分），把ACE2比喻成锁子的话，ACE2直接和S-RBD结合的部分就是“锁芯”。不同病毒的S-RBD就相当于不同的“牙花”，不同动物的的ACE2就相当于不同的“锁芯”，所以牙花上钥匙锯齿的相似度越高，开锁子的效率就越高。
而用表达跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)，时候即可看到在用针对S-RBD的MERS的单克隆抗体(mAb)处理之后，MERS假病毒入胞的水平上升了。
而这个ADE效应的机理跟DPP4这个受体无关，如果假病毒是进入表达DPP4的细胞，抗体浓度越大，入胞效率越低。说明抗体可以阻断病毒通过DPP4入胞这个过程。
但是在单独表达CD32A受体的的细胞上，可以看到抗体可以在中间浓度（100ng/ml）介导病毒感染细胞的增强。而在两个受体同时表达细胞上，结果是类似的，表现出先降低，中间升高，最后再降低的趋势。也就是抗体浓度不高不低的情况下，是促进病毒的ADE效应的。
此外，另外一篇PNAS文章也介绍说蛋白裂解过程拓宽了MERS-CoV的细胞嗜性[12]。
根据这些文献，可以得出推论：
病毒可能在中和抗体存在的情况下，促进了细胞表面的入胞病毒数量，从而出现ADE效应。
也可能存在有FcγR这样的促进病毒入胞的机理，从而出现ADE效应。
最后就是血清中和抗体（NAb）水平可以促进肺部促炎性巨噬细胞浸润升高、促进伤口愈合的巨噬细胞减少。
所以疫苗设计的关键可能在于诱导机体的抗体效价一定要高，不然可能还是个危险因素。
